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DNA-Nachweis

Dieses Thema im Forum "Off-Topic-Location" wurde erstellt von Linguist, 27 Februar 2009.

  1. Linguist
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    Ich bereite mich gerade auf meine Bioklausur am Montag vor und bin hinsichtlich der DNA-Analyse etwas ins Straucheln geraten :tongue:

    Den ganzen Vorgang habe ich in soweit verstanden, dass...

    1) Die gefundene DNA Menge oft nicht ausreicht und durch die Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird. Verstanden.

    2) Durch Hinzugabe einer bestimmten Menge eines Restriktionsenzyms wird die DNA in einzelne Fragmente zerteilt. Verstanden.

    3) Die zerteilte DNA gebe ich nun in die Taschen des Agarosegels. Verstanden.

    4) Da die DNA insgesamt negativ geladen ist, wandern die Fragmente während der Gelelektrophorese Richtung Pluspol. Durch unterschiedliche Beschaffenheit der einzelnen Fragmente durchschreiten manche schneller, manche langsamer das Gel. Es lagern sich unterschiedliche Banden ab. Verstanden.

    5) Die DNA Fragmente werden nun durch die Southern-Blot Methode einsträngig gemacht. Verstanden.

    6) Radioaktive RNA-Stücke werden nun in das Gel gegeben und lagern sich komplementär an die Fragmente an. Verstanden.

    7) Übertragung auf eine Nylonmembran und Auflegen eines auf radioaktive Strahlen reagierenden Film. Verstanden.

    8) Durch die radioaktiven Strahlen färbt der Film sich entsprechend und das Bandenmuster wird sichtbar. Man kann so nun 2 Bandenmuster verschiedener Proben vergleichen, um den Täter zu identifizieren. Verstanden.

    Was ich nicht verstehe:

    Wozu die ganze scheiße mit VNTR's, also kleine, nicht codierende DNA Fragmente? Ich habe doch durch die oben geschilderten Schritte schon ein Bandenmuster, dass ich mit anderen vergleichen kann! Wozu soll ich dann noch die VNTR's untersuchen?

    Das habe ich noch nicht so ganz verstanden...


    Edit1: Danke an lukeduke.
     
    #1
    Linguist, 27 Februar 2009
  2. luke.duke
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    nicht angegeben
    4) Da die DNA insgesamt negativ geladen ist (Phosphatrest), wandert sie Richtung Plus-Pol!

    Was ist VTRN? :ratlos:

    Die unterschiedliche Beschaffenheit ist übrigens die Größe. Große DNA wandert langsamer durch das Netz des Gels als kleine, da die Kleinen besser durch das Netzwerk kommen.
     
    #2
    luke.duke, 27 Februar 2009
  3. Linguist
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    Minisatelliten (VNTR, variable number tandem repeats), kleine, sich wiederholende Abschnitte im Erbgut
     
    #3
    Linguist, 27 Februar 2009
  4. User 32843
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    nicht angegeben
    Und: Du überträgst die DNA durch southern blotting auf die Membran, und dort gibst du dann die radioaktiv markierten DNA-Stücke drauf. Die gibst du nicht aufs Gel.

    Ich habe noch nie etwas von VTRNs gehört... :ratlos:

    Edit: ich glaube ich verstehe was du meinst. Die Variabilität der Sequenz der DNA ist in nicht-codierenden Sequenzen relativ gross, d.h. du kannst mit grösserer Genauigkeit sagen ob zwei Proben übereinstimmen. Wenn du nur das Bandenmuster analysierst kannst du nicht sicher sein, da einige Schnittstellen bei praktisch allen Menschen gleich sind.
     
    #4
    User 32843, 27 Februar 2009
  5. luke.duke
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    nicht angegeben
    Ah ja, okay. Und was wird mit denen zusätzlich bei der DNA-Analyse gemacht und was verstehst du daran nicht?
     
    #5
    luke.duke, 27 Februar 2009
  6. Linguist
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    Wieso die denn untersucht bzw. überhaupt genannt werden. Mir kanns doch total egal sein, welche Nukleotide die DNA aufweist. Hauptsache die Bandenmuster stimmen überein. Wieso untersuche ich noch die VNTR's?
     
    #6
    Linguist, 27 Februar 2009
  7. luke.duke
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    nicht angegeben
    http://de.wikipedia.org/wiki/Genetischer_Fingerabdruck

    Wikipedia hilft... :zwinker:

    Das sollte alles beantworten! :smile:
     
    #7
    luke.duke, 27 Februar 2009
  8. Linguist
    Linguist (26)
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    vergeben und glücklich
    Glaube ich verstehe. Also entnehme ich jeweils beiden Proben aus jeweils der gleichen Bande so ein kleines Stück DNA. Dann behandle ich das mit komplementären RNA Stückchen. Binden die an beide Proben, so ist die DNA identisch, denn diese kurzen DNA Stücke sind hochvariabel. Richtig?


    Danke. Werd ich mir mal geben :grin:
     
    #8
    Linguist, 27 Februar 2009
  9. luke.duke
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    nicht angegeben
    Sie werden nicht zusätzlich untersucht, sondern nur diese Bereiche, soweit ich das verstehe.

    Vermutlich hat das auch rechtlich-ethisch-moralische Gründe. Denn durch diese Bereiche kannst du keine Krankheiten etc. diagnostizieren, was auch bei der Sache erstmal völlig uninteressant ist. WENN es um Verbrecherjagd oder sowas geht.

    Außerdem ist, wie ich zietiert habe, die Wahrscheinlichkeit einer gleichen VNTR bei einem anderen Menschen sehr gering. Somit ist die Wahrscheinlichkeit sehr hoch, dass man den Richtigen hat! :smile:

    Vorsicht: Nicht alles, was ich zitiert habe, findest du unter dem Link!

    Viel Erfolg, ich bin raus!
     
    #9
    luke.duke, 27 Februar 2009
  10. User 32843
    User 32843 (29)
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    Du lässt an die VNTRs keine RNA-Stückchen binden, sondern du sequenzierst sie. Dies darum, weil RNA auch binden kann wenn die Sequenz nicht 100% übereinstimmt. Wenn du sie sequenzierst, dann steht ziemlich eindeutig fest dass es sich um das gleiche Genom handelt, wenn sie übereinstimmen. Das kannst du nur durchs Bandenmuster nicht mit Sicherheit sagen. Man sequenziert VNTRs und keine normalen Gene, weil die Variabilität dort höher ist. Normale Gene codieren ja für Proteine, wenn dort viele Mutationen auftreten würden, dann würde das zu Problemen führen. In nicht codierenden Regionen ist die Variabilität aber sehr hoch, weil es keine Selektion gibt, da es überhaupt keine Rolle spielt welche Sequenz das Genom dort aufweist.
     
    #10
    User 32843, 27 Februar 2009
  11. User 43919
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    Melde ich mich mal auch zu wort, heute klausur darüber geschrieben :zwinker:

    Es gibt VNTR's und STR's.
    Beides sind nicht codierende Abschnitte auf der DNA die Gene flankieren, deswegen kann man sich auch die primer dazu basteln und die per PCR zu amplifizieren.
    STR's sind short tandem repeats.
    VNTR's wie schon gesagt variable numbers of tandem repeats.

    Man macht heutzutage dafür gar keinen Southern Blot mehr.
    Da durch Mutationen menschen verschiedene Anzahl an repeats haben, zb einmal 10 und 15 (einmal von der mutter, einmal vom vater vererbt) amplifiziert man die einfach per PCR und trennt sie dann in einem Gel auf.
    Dadurch bekommt man dann ein Bandenmuster und kann das vergleichen.

    Man nimmt diese Sequenzen zum vergleich, weil diese unterschiedlich beim menschen sind.
    Würdest du abschnitte vergleichen auf denen gene liegen, würde das bei allen menschen gleich aussehen, weil wir alle das gen für insulin in uns tragen zb.
    Zudem werden die aus rechtlichen gründen verwendet, weil man sonst mutationen finden könnte, die aufschluss auf krankheiten geben würde.
    In deutschland müssen 13 STR's verglichen werden, damit man die DNA eindeutig einer person zuordnen kann und damit das vor gericht halt hat.
    Beim vaterschaftstest werden 9 STR's verglichen.

    Und noch zum Southern blot :zwinker:
    Das blotten bedeutet das man die DNA über kapillarkräfte von dem gel auf die nitrocellulosemembran überträgt. Dort wird sie dann fixiert, denauturiert und dann kommen die makierten sonden dazu.


    Ich hoffe ich konnte dir ein bissl helfen.


    ps bevor jemand fragt, nein das ist kein normales schulwissen, sondern ich mach eine ausbildung zur BTA (biologisch technische assistentin) da ist das mein täglich brot
     
    #11
    User 43919, 27 Februar 2009
  12. Linguist
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    Der wikipedia Artikel gibt größtenteils das wieder, was auch schon in meinem Material steht. Trotzdem verstehe ich das immer noch nicht so ganz. :geknickt: (Iac-Operon-Modell ging so einfach von der Hand)

    Ich versuche das jetzt nochmal en Detail und Step by Step zusammenzufassen, da ich nur über Verständnis lernen kann.

    1) DNA 1 und DNA 2 sind gegeben. Durch Zugabe von Restriktionsenzymen wird die DNA in einzelne Fragmente aufgeteilt.

    Wie kann ich da denn jetzt gewährleisten, dass ich auch tatsächlich die 8-15 nicht-codierende Abschnitte untersuche? Das spielt sich doch auf molekularbiologischer Ebene ab, also kann ich da doch schlecht von 2 Chromosomen zweier Individuen einfach das Stück unten rechts abschneiden.

    2) Die zu untersuchenden 8-15 Fragmente (VNTRs oder STRs) werden durch Gelelektrophorese getrennt. Ein typisches Bandenmuster ergibt sich.

    @BBA: Du sagst Southern Blot ist an dieser Stelle nicht notwendig. Wie machst du das Bandenmuster dann sichtbar?

    3) Durch Southern Blot werden die Fragmente auf eine Nylonmembran gebracht und...

    @ProximaCentauri: Tut mir leid, aber ich verstehe den Begriff "sequenzieren" in diesem Zusammenhang nicht. Kannst du mir das genauer erläutern?:schuechte

    Sorry, im Moment will nichts mehr in meinen Kopf hinein. Der wikipedia Artikel bringt keine Klarheit und im Linder steht auch nur die PCR ausführlich beschrieben. Oder mir fällt das einfach nur unheimlich schwer.

    Danke :smile:
     
    #12
    Linguist, 27 Februar 2009
  13. User 43919
    User 43919 (27)
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    Ich versuchs dir nochmal ein bissl anders zu erklären.
    So wie ich es herauslese, weißt du wie eine PCR funktioniert, das ist nämlich vorraussetztung.
    Einen Soutern Blot macht man zb bei RFLP (restriktionsfragmentlängenpolymophismus) aber egal...

    Im nicht kodierenden Breich der DNA findet man loci, in denen sich kleine DNA-breiche aus nur wenigen Basen tandempartig wiederholen. Und diese Bereiche nennt man VNTR's oder STR's
    Die Anzahl der Wiederholungen dieser VNTR's oder STR's variiert in der menschlichen Population.
    Die bei den MEnschen unterschiedlich lokalisierten loci hat man mit den Namen bezeichnet, die oft rückschlüsse auf benachtbarte Gene geben, zb THO1, Gen für das schilddrüsenhormon.

    VNTRs und STRs unterscheiden sich in der ihrer Länge, dh in der Anzahl der Basenabfolge pro Wiederholungen, und diese wiederholungen nennt man repeats.
    VNTRs umfassen in der regel 50 wiederholungen. VNTR's sind auch länger, zb 10-150 bp ist EIN VNTR und der Wiederholt sich dann bis zu 50x.

    STRs sind kurze sequenzen, die sich auch Tandemartig anordnen. Sie bestehen aber aus nur 2-7 bp dh. zb (TCAT TCAT TCAT TCAT)
    Und das TCAT wiederholt sich zb 10x

    Und die basensequenzen die diese verschiedenen loci einrahmen, sind bei allen menschen gleich. und für diese Sequenzen, die die STRs und einrahmen konstruiert man Primer für eine PCR.
    und dann werden die STRs ganz einfach per PCR vermerht und dann durch die gelelektrophorese getrennt.

    Da VNTRs länger sind, kann man die manchmal halt nicht mehr per PRC amplifizieren, da macht man dann halt den southern blot.
    Nur eigentlich werden VNTRs gar nicht mehr verwendet, es werden immer STRs verglichen.

    aber wenn du VNTRs hast dann konstruierst du dir dafür eine Sonde, die radioaktiv makiert ist.
    Dann schneidest du deine DNA mit vielen verschiedenen Restriktionsenzymen. Diese geschnittene DNA trennst du dann in einem gel auf. Dann überträgst du die DNA von dem gel auf deine Membran, also blottest sie. Fixierst sie auf der Mebran, trennst sie in einzelstränge auf, zb durch chemikalien und gibst dann deine Sonde dazu.
    Die sonde bindet jetzt an alle komplementären sequenzen, auch wenn nur 50 bp gleich sind.
    Dann wäscht du die membran und alles was nicht gebunden hat an sonden wird abgewaschen.
    Dann machst du ein "photo", da die sonden radioaktiv makiert sind. Jetzt werden die banden, an denen die sonden gebunden haben sichtbar und du kannst sie vergleichen.
    Da ein VNTR mit 25 repeats nicht so weit im gel wandert wie ein VNTR mit 15 repeats, kann man die banden jetzt vergleichen, von ihrer läge her.

    Je länger das DNA fragment, desto länger braucht es um im gel zu wandern.
    Kleine fragmente wandern ganz schnell durchs gel.

    Achso ja, wenn du eine gesammte genomische DNA schneidest, mit ganz vielen Restriktionsenzymen, und das dann in einem gel auftrennst, dann bekommst du keine schönen banden, wie das immer in büchern ausschaut, sondern einen schmier. Es ist sozusagen alles eingefärbt, weil man so viele verschiedengroße dna fragmente hat.
    Deswegen makiert man die dna fragmente, für die man sich interessiert mit den sonden beim southern blot.
    Wenn du das foto machst, siehst du nur noch die banden, wo die sonde gebunden hat und die restliche dna die noch da ist nicht.
     
    #13
    User 43919, 27 Februar 2009
  14. zickzackbum
    Verbringt hier viel Zeit
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    nicht angegeben
    Hier stimmts zwar, im Prinzip ist es aber auch die räumliche Struktur. Open circle oder supercoiled Plasmide wandern anders als gleich lange lineare DNA.

    Und die treibende Kraft beim Southern Blot können entweder Kapillarkräfte sein, man kann aber auch ein elektrisches Feld senkrecht zur Ebene des Gels anlegen.
     
    #14
    zickzackbum, 28 Februar 2009
  15. wanci
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    Versteh auch nicht, warum man überhaupt Southern Blot machen sollte.

    Die Sequenz interessiert uns doch gar nicht. Wenn man einfach ein paar loci mit Repeats nimmt (Anzahl ist ja bei jedem Individuum verschieden), diese amplifiziert und dann eine Elektrophorese macht, hat man doch schon ein schönes Bandenmuster, dass eine Identifizierung zu 99,99% gewährleisten sollte.

    Wenn du die Elektrophorese mit Ethidiumbromid machst, kannst du es auch gleich direkt sichtbar machen, also kein Blotting nötig. Ethidiumbromid setzt sich quasi an der DNA fest und du kannst es mit so einem UV-Gerät sichtbar machen.

    Diese Repeat-Regionen werden von bestimmten, bei jedem gleichen Sequenzen umgeben. Wenn du dafür den Primer baust oder einfach ein Restriktionsenzym nimmst, das an entsprechender Stelle schneidet, ist das eigentlich ganz einfach.
     
    #15
    wanci, 28 Februar 2009
  16. Linguist
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    vergeben und glücklich
    Danke sehr :smile: Mit klarem Kopf habe ich das jetzt auf Anhieb verstanden... Der Lehrer hatte da leider nur wikipedia Material zu ausgegeben und das war unverständlich. Im Buch stand auch nix darüber. Aber jetzt hab ichs kapiert :smile:
     
    #16
    Linguist, 1 März 2009

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